Molecular detection of Leishmania infantum in donkeys and mules under semiarid conditions in Brazil / Detecção molecular de Leishmania infantum em asininos e muares sob condições semiáridas

Abstract Visceral leishmaniasis is a parasitic zoonosis that mainly affects poorest and most vulnerable populations, and domestic dogs are considered to be the main source of infection to the vector and therefore humans. However, several studies have investigated the role of other vertebrate hosts in the disease cycle. In this context, the aim of the present study was to conduct a survey of Leishmania infantum infection in donkeys and mules living in a semiarid region of Brazil. Whole blood sampled from 72 equids (65 donkeys and 7 mules) was used to perform molecular diagnosis using the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique. A total of 25% of the samples (18/72) were positive through qPCR, but there were no significant differences between the species (donkeys or mules), sex (male or female) and abandonment situation of the animals (yes or no). Donkeys and mules living under semiarid conditions have high frequency of L. infantum infection. It is therefore worth assigning importance to these species in the epidemiological cycle of visceral leishmaniasis, either as potential reservoirs or just as an abundant food source for vectors.

Resumo A leishmaniose visceral é uma zoonose parasitária que afeta principalmente populações mais pobres e vulneráveis, e os cães domésticos são considerados as principais fontes de infecção para o vetor e, portanto, para os humanos. Porém diversos estudos têm pesquisado o papel de outros hospedeiros vertebrados no ciclo da doença. Neste contexto, objetivou-se realizar um levantamento da infecção por Leishmania infantum em asininos e muares, vivendo em região semiárida do Brasil. Foi utilizado sangue total de 72 equídeos (65 asininos e 7 muares) para a realização de diagnóstico molecular por meio da técnica de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR). Um total de 25% das amostras (18/72) resultaram positivas na qPCR, porém não houve diferença significativa entre as espécies (asininos e muares), sexo (macho e fêmea) e situação de abandono dos animais (sim ou não). Asininos e muares, vivendo em condições semiáridas, apresentam alta frequência de infecção por L. infantum, sendo válido atribuir importância a essas espécies no ciclo epidemiológico da leishmaniose visceral, seja como um reservatório em potencial, seja apenas como uma fonte alimentar abundante para os vetores.

Comparison of serological and molecular tests to investigate Leishmania spp. infections in stray dogs from an area of intense visceral leishmaniasis transmission in Brazil / Comparação de testes sorológicos e moleculares para investigar infecções por Leishmania spp. em cães errantes de uma área de intensa transmissão de leishmaniose visceral no Brasil

Abstract The aim of this study was to investigate the level of exposure to Leishmania infection in stray dogs in an area of intense visceral leishmaniasis transmission in the state of Pernambuco, Brazil. Blood samples from 178 dogs were analyzed using serological and molecular assays: rapid immunochromatographic test (ICT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescence antibody test (IFAT), and conventional and quantitative polymerase chain reaction (cPCR and qPCR). Positivity values obtained with serological tests were 71.4% (127/178), 70.2% (125/178), and 50.6% (90/178) using ICT, ELISA, and IFAT, respectively, with 38.8% (69/178) of the dogs were simultaneously positive for all three tests. The positivity values obtained with cPCR and qPCR were 20.2% (36/178) and 38.8% (69/178), respectively, with 11.8% (21/178) testing positive in both molecular assays. Overall, 87.1% (155/178) were positive for anti-Leishmania spp. antibodies and/or Leishmania spp. DNA. Positivity to one or more tests was statistically associated with lymphadenomegaly, skin lesions, lymphocytosis, anemia and hyperproteinemia. The results of this study revealed a high level of exposure to Leishmania in stray dogs in an area of intense human visceral leishmaniasis transmission, suggesting that dogs play a role as reservoirs in the transmission cycle of this zoonosis.

Resumo O objetivo deste estudo foi investigar o nível de exposição à infecção por Leishmania em cães errantes de uma área de transmissão intensa de leishmaniose visceral no estado de Pernambuco. Amostras de sangue de 178 cães foram avaliadas por testes sorológicos e moleculares: teste imunocromatográfico (IC), ensaio imunoenzimático (ELISA), teste de imunofluorescência de anticorpos (RIFI), reação em cadeia da polimerase convencional e quantitativa (cPCR e qPCR). Os valores de positividade obtidos com os testes sorológicos foram 71,4% (127/178), 70,2% (125/178) e 50,6% (90/178) com IC, ELISA e RIFI, respectivamente. E com 38,8% (69/178) dos cães mostraram-se simultaneamente positivos aos três testes. Os valores de positividade obtidos por cPCR e qPCR foram 20,2% (36/178) e 38,8% (69/178), respectivamente. E com 11,8% (21/178) dos cães foram positivos em ambos os testes moleculares. No geral, 87,1% (155/178) foram positivos para anticorpos anti-Leishmania spp. e/ou material genético de Leishmania spp. A positividade a um ou mais testes foi estatisticamente associada à linfonodomegalia, lesões cutâneas, linfocitose, anemia e hiperproteinemia. Os resultados do estudo revelam um alto nível de exposição à Leishmania spp. em cães errantes em uma área de transmissão intensa de leishmaniose visceral humana, sugerindo que eles podem desempenhar um papel como reservatórios no ciclo de transmissão dessa zoonose.

Polymerase chain reaction using conjunctival swab samples for detecting Leishmania DNA in dogs / Reação em cadeia da polimerase usando amostras de Swab de conjuntiva para detecção de DNA de Leishmania em cães

Abstract The dog is the main domestic reservoir of Leishmania and font of infection for the vector, constituting an important host for the transmission of the parasite to humans. Non-invasive collection of swab samples for leishmaniasis diagnosis has been a promising alternative. This study analyzed the positivity of polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of canine leishmaniasis in conjunctiva samples. DNA extraction was performed using SDS 20% and PCR was performed using 13A/13B primers that amplify 120-bp of Leishmania kDNA. Of the 77 dogs analyzed, 50 (64.93%) had ocular changes: 25 (32.47%) dogs had periocular lesion, 41 (53.25%) dogs had purulent eye discharge, and 17 (22.08%) dogs had both signals. PCR was positive in 35 dogs (45.45%), and there was no significant difference between dogs with and without ocular signals (p=0.4074). PCR positivity was significant higher in dogs without periocular injury (p=0.0018). Conjunctive PCR, a less invasive, fast, and painless collection technique, is indicated to complement the diagnosis, especially in dogs without periocular injury, independent of the presence of purulent eye discharge.

Resumo O cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania e também fonte de infecção para o vetor, constituindo um importante hospedeiro para a transmissão do parasita ao homem. A coleta não invasiva de amostras em swab para diagnóstico das leishmanioses tem sido uma alternativa promissora. Este estudo analisou a positividade da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico de leishmaniose canina em amostras de conjuntiva. A extração do DNA foi realizada com SDS 20%. A PCR foi realizada com primers 13A/13B que amplificam 120-pb do kDNA de Leishmania. Dos 77 cães analisados, 50 (64,93%) tiveram alterações oculares; 25 (32,47%) cães tiveram uma lesão periocular; 41 (53,25%) tiveram secreção ocular purulenta e 17 (22,08%) cães tiveram ambos os sinais. A PCR foi positiva em 35 cães (45,45%) e não houve diferença significativa em cães com e sem sinais oculares (p = 0,4074). A positividade da PCR foi significativamente maior em cães sem lesão periocular (p = 0,0018). PCR em conjuntiva, uma técnica de coleta menos invasiva, rápida e indolor, é indicada para complementar o diagnóstico, principalmente em cães sem lesão periocular, independentemente da presença de secreção ocular purulenta.

The gene expression of Leishmania infantum chagasi inside Lutzomyia longipalpis, the main vector of visceral leishmaniasis in Brazil

Leishmania infantum chagasi is the causative agent and Lutzomyia longipalpis is the main vector of visceral leishmaniasis in the Americas. We investigated the expression of Leishmania genes within L. longipalpis after artificial infection. mRNAs from genes involved in sugar and amino acid metabolism were upregulated at times of high parasite proliferation inside the insect. mRNAs from genes involved in metacyclogenesis had higher expression in late stages of infection. Other modulated genes of interest were involved in immunomodulation, purine salvage pathway and protein recycling. These data reveal aspects of the adaptation of the parasite to the microenvironment of the vector gut and reflect the preparation for infection in the vertebrate.

Investigation of canine visceral leishmaniasis in a non-endemic area in Brazil and the comparison of serological and molecular diagnostic tests

Abstract INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) is an important zoonosis in Brazil. Previous identification of parasitized dogs can also help prevent the disease in humans, even in non-endemic areas of the country. The Brazilian Ministry of Health recommends diagnosis in dogs using a DPP® (rapid test) as a screening test and an immunoenzymatic assay (ELISA) as a confirmatory test (DPP®+ELISA), and culling infected dogs as a legal control measure. However, the accuracy of these serological tests has been questioned. METHODS: VL in dogs was investigated in a non-endemic area of the São Paulo state for three consecutive years, and the performances of different diagnostic tests were compared. RESULTS: A total of 331 dog samples were collected in 2015, 373 in 2016, and 347 in 2017. The seroprevalence by DPP®+ELISA was 3.3, 3.2, and 0.3%, respectively, and by indirect immunofluorescence assay (IFA), it was 3.0, 5.6, and 5.5%, respectively. ELISA confirmed 18.4% of DPP® positive samples. The concordance between the IFA and DPP® was 83.9%. The concordance between IFA and DPP®+ELISA was 92.9%. A molecular diagnostic test (PCR) was performed in 63.2% of the seropositive samples, all of which were negative. CONCLUSIONS: In non-endemic areas, diagnostic tests in dogs should be carefully evaluated to avoid false results.

Natural Infection by Leishmania infantum in domestic cats (Felis catus) in a municipality of moderate transmission in the Brazilian semi-arid region / Infecção natural por Leishmania infantum em gatos domésticos (Felis catus) em município de transmissão moderada no semiárido brasileiro

Abstract The main clinical, anatomopathological, and molecular aspects of the infection by Leishmania infantum are described in two cats with multicentric cutaneous, nodular, and ulcerated lesions. The animals were submitted to a clinical examination, followed by serological, molecular and parasitological exams, with culture and isolation of the parasite, and subsequent isoenzymatic characterization. The animals were euthanized and necropsied. Case 1 was an adult, female, mixed-bred stray cat. Case 2 was an adult, male, mixed-bred and domiciled cat. Both were positive for the presence of anti-L. infantum antibodies. In the cytology of the cutaneous nodules and lymph nodes, amastigote forms of Leishmania spp. could be visualized, free and in the interior of the macrophages. In the histopathology, the lesions were characterized by nodular granulomatous and/or ulcerative dermatitis, associated to amastigote forms of Leishmania spp. By means of the polymerase chain reaction, the sequence of the L. infantum kDNA minicircle was amplified. It is concluded that the infection by L. infantum occurs in cats in the State of Paraíba, Northeast region of Brazil and the need to understand the immunological profile of the visceral leishmaniasis in the feline population is highlighted with aimed at the control measures in public health.

Resumo Descrevem-se os principais aspectos clínicos, anatomopatológicos e moleculares da infecção por Leishmania infantum em dois gatos, cuja queixa era de lesões cutâneas multicêntricas, nodulares e ulceradas. Os animais foram submetidos à avaliação clínica, seguida de exames sorológicos, molecular e parasitológico, com cultura e isolamento do parasita e posterior caracterização isoenzimática. Os animais foram eutanasiados e encaminhados para a necropsia. O caso 1 era uma gata adulta, sem raça definida e errante. O caso 2 era um gato adulto, sem raça definida e domiciliado. Ambos foram positivos para a presença de anticorpos anti-L. infantum. Na citologia dos nódulos cutâneos e linfonodos, puderam ser visualizadas formas amastigotas de Leishmania spp. livres e no interior de macrófagos. Na histopatologia, as lesões se caracterizavam por dermatite granulomatosa nodular e/ou ulcerativa, associadas a formas amastigotas de Leishmania spp. Por meio da reação em cadeia da polimerase, amplificou-se a sequência do minicírculo do kDNA de L. infantum. Conclui-se que a infecção por L. infantum ocorre em gatos no estado da Paraíba, região Nordeste do Brasil. Deve-se ressaltar a necessidade de compreender o perfil imunológico e epidemiológico da leishmaniose visceral na população felina, com vistas às medidas de controle em saúde pública.

Transmission of Leishmania infantum from cats to dogs / Transmissão de Leishmania infantum de gatos para cães

Abstract Leishmania infantum infection in cats has been reported in several countries, including Brazil. However, the transmission of visceral leishmaniasis (VL) from cats to another host has not been proven yet. Therefore, the aim of this study was to verify the possibility of L. infantum transmission from cats to dogs. In order to verify the possibility of VL transmission from the cat to the dog, xenodiagnosis was carried out in a VL-positive cat, using 55 female Lutzomyia longipalpis. Five days later, 40 insects were dissected to verify Leishmania infection. The remaining 15 females were fed in a healthy dog. The potential infection of the dog was verified through clinical, serological, parasitological examinations, and PCR, at three, six, and twelve months post-infection. All 55 L. longipalpis females became visibly engorged. Leishmania promastigotes were detected in 27.5% of the dissected insects. Leishmania infection in the dog was confirmed upon first evaluation. DNA sequencing of the parasite isolated from the cat confirmed L. infantum infection and showed 99% similarity with the L. infantum DNA sequences from the dogs. Through this study, it was possible to confirm the L. infantum experimental transmission from a domestic cat to a domestic dog through its biological vector L. longipalpis.

Resumo A infecção por Leishmania infantum em gatos tem sido relatada em vários países, incluindo o Brasil. No entanto, a transmissão da leishmaniose visceral (LV) de gatos para outro hospedeiro ainda não foi comprovada. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar a possibilidade de transmissão de L. infantum de gatos para cães. Para verificar a possibilidade de transmissão da LV do gato para o cão, foi realizado xenodiagnóstico em um gato com LV, utilizando-se 55 fêmeas de Lutzomyia longipalpis. Cinco dias depois, 40 insetos foram dissecados para verificar a infecção por Leishmania. As 15 fêmeas restantes foram alimentadas em um cão saudável. A possível infecção no cão foi verificada por meio de exames clínicos, sorológicos, parasitológicos e PCR, três, seis e doze meses após a infecção. Todas as 55 fêmeas de L. longipalpis ficaram visivelmente ingurgitadas. Promastigotas de Leishmania foram detectadas em 27,5% dos insetos dissecados. A infecção por Leishmania no cão foi confirmada na primeira avaliação. O sequenciamento do DNA do parasito isolado do gato confirmou a infecção por L. infantum e apresentou 99% de similaridade com sequências de DNA de L. infantum de cães. Através deste estudo, foi possível confirmar a transmissão experimental de L. infantum de um gato doméstico para um cão doméstico através do seu vetor biológico L. longipalpis.

Serological study of feline leishmaniasis and molecular detection of Leishmania infantum and Leishmania braziliensis in cats (Felis catus) / Pesquisa sorológica da leishmaniose felina e detecção molecular de Leishmania infantum e Leishmania braziliensis em gatos (Felis catus)

Abstract Blood samples and swabs from ocular conjunctiva and mouth were obtained from 64 cats. Of 64 serum samples, 19 were positive for Leishmania antibodies by ELISA (29.80%). Eight cats were positive by PCR (12.5%) in swab samples from mouth and/or ocular mucosa. Poor kappa agreement between serological and molecular results (k = 0.16) was obtained. From five positive PCR samples one was L. braziliensis and four were L. infantum. Phylogenetic analysis performed with the five isolates of Leishmania, showed that samples of L. infantum isolated from the cats were phylogenetically close to those isolated from domestic dogs in Brazil, while the L. braziliensis is very similar to the one described in humans in Venezuela. The study demonstrated that, despite high seropositivity for Leishmania in cats living in the study region, poor agreement between serological and molecular results indicate that positive serology is not indicative of Leishmania infection in cats. Parasite DNA can be detected in ocular conjunctiva and oral swabs from cats, indicating that such samples could be used for diagnosis. Results of phylogenetic analyzes show that L. infantum circulating in Brazil is capable of infecting different hosts, demonstrating the parasite's ability to overcome the interspecies barrier.

Resumo Amostras de sangue e swabs da conjuntiva ocular e oral foram obtidas de 64 gatos. Das 64 amostras de soro, 19 foram positivas para anticorpos contra Leishmania por ELISA (29,80%). Oito gatos foram positivos por PCR (12,5%) em amostras de swab da boca e / ou mucosa ocular. Demonstrou-se baixa concordância kappa entre os resultados sorológicos e moleculares (k = 0,16). Das cinco amostras positivas para PCR, uma era L. braziliensis e quatro eram L infantum. A análise filogenética realizada com os cinco isolados de Leishmania, mostrou que amostras de L. infantum, isoladas dos gatos, eram filogeneticamente próximas às isoladas de cães domésticos do Brasil enquanto L. braziliensis era muito semelhante ao descrito em humanos na Venezuela. O estudo demonstrou que, apesar da alta soropositividade para Leishmania, em gatos que vivem na região do estudo, pouca concordância entre os resultados sorológicos e moleculares indica que a sorologia positiva não é indicativa de infecção por Leishmania em gatos. O DNA do parasita pode ser detectado na conjuntiva ocular e nas zaragatoas orais de gatos, indicando que essas amostras podem ser usadas para o diagnóstico. . Resultados de análises filogenéticas mostram que L. infantum, circulando no Brasil, é capaz de infectar diferentes hospedeiros, demonstrando a capacidade do parasita de superar a barreira interespécies.

Clinical-dermatological, histological abnormalities and prevalence of Trypanosoma caninum and Leishmania infantum in dogs from Midwest region of Brazil / Anormalidades clínico-dermatológicas, histológicas e prevalência de Trypanosoma caninum e Leishmania infantum em cães da região Centro-Oeste do Brasil

Abstract Leishmania infantum is a trypanosomatid that causes parasitic dermatopathy in dogs. Trypanosoma caninum is another trypanosomatid, which infects the skin of dogs, although cutaneous abnormalities are absent. This study aimed to investigate the occurrence of T. caninum infection and its associated cutaneous and histological changes and compare it with the occurrence of L. infantum infection in dogs. The study included 150 dogs, of which T. caninum infection was identified in 3 (2%) and L. infantum infection in 15 (10%) of them, with no association (p>0.05) of these infections with the breed, gender, age, or cutaneous abnormalities. The cutaneous abnormalities were based on 1 (4.8%) and 12 (57.1%) dogs infected by T. caninum and L. infantum, respectively. The dermatohistopathological abnormalities in the dogs infected with T. caninum included mild perivascular lymphohistioplasmacytic infiltrates in the clinically asymptomatic ones, while in those with dermatological abnormalities, acanthosis, epidermal orthokeratotic hyperkeratosis, melanomacrophages, and co-infection with Microsporum sp. and Trichophyton sp. were observed. InL. infantum infected, the histopathological findings included chronic granulomatous inflammatory infiltrates and structures compatible with amastigotes. Despite the low frequency of T. caninum infection, our findings suggest that this trypanosomatid, unlike L. infantum, does not cause any macroscopic skin abnormalities.

Resumo Leishmania infantum é um tripanosomatídeo que causa dermatopatia parasitária em cães. Trypanosoma caninum é outro tripanosomatídeo, que infecta a pele de cães, embora anormalidades cutâneas sejam ausentes. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência da infecção por T. caninum e suas alterações cutâneas e histológicas associadas e compará-las com a ocorrência da infecção por L. infantum em cães. O estudo incluiu 150 cães, dos quais a infecção por T. caninum foi identificada em 3 (2%) e a infecção por L. infantum em 15 (10%) deles, sem associação (p>0,05) dessas infecções com a raça, sexo, idade ou anormalidades cutâneas. As alterações cutâneas foram observadas em 1 (4,8%) e 12 (57,1%) cães infectados por T. caninum e L. infantum, respectivamente. As anormalidades dermato-histopatológicas nos cães infectados por T. caninum incluíram infiltrados linfo-histioplasmocitários perivasculares leves nos clinicamente assintomáticos, enquanto naqueles com anormalidades dermatológicas, foram observados acantose, hiperqueratose ortoqueratótica epidermal e melanomacrófagos e co-infecção por Microsporum sp. e Trichophyton sp. Nos cães infectados por L. infantum, os achados histopatológicos incluíram infiltrados inflamatórios granulomatosos crônicos e estruturas compatíveis com amastigotas. A despeito da baixa frequência da infecção por T. caninum, nossos achados sugerem que esse tripanosomatídeo, diferentemente de L. infantum, não causa anormalidades macroscópicas na pele.

Autochthonous canine visceral leishmaniasis cases occur in Paraná state since 2012: isolation and identification of Leishmania infantum / Leishmaniose visceral canina autóctone ocorre no estado do Paraná desde 2012: isolamento e identificação de Leishmania infantum

Abstract The aim of this study was to confirm the emergence of canine visceral leishmaniasis among dogs in Foz do Iguaçu. The disease was diagnosed through the isolation and molecular identification of Leishmania infantum. In the first sample collection stage (2012), three lymph node aspirates and 46 buffy coat samples were obtained mostly from the dogs that were seroreagents for leishmaniasis. In the second sample collection stage (2013), the buffy coat samples were collected from 376 dogs located close to Paraguay, Paraná river, center and peripheral parts of the city. The DNA from the six isolates, four from the first sampling stage (4/49) and two from the second sampling stage (2/376), was subjected to polymerase chain reaction using the K26F/R primers. The isolate was confirmed as L. infantum by sequencing. As none of the dogs had ever left the city, the isolates were confirmed as autochthonous. Further, the study confirmed the emergence of canine visceral leishmaniasis in Paraná through the identification of L. infantum among dogs in Foz do Iguaçu city. Hence, collaborative control measures should be designed and implemented by the public agencies and research institutions of Brazil, Argentina, and Paraguay to control the spread of visceral leishmaniasis.

Resumo O objetivo deste estudo foi confirmar a emergência da leishmaniose visceral canina em Foz do Iguaçu próximo à fronteira com a Argentina e ao Paraguai, por meio do isolamento e identificação molecular de Leishmania infantum. Em um primeiro estágio de coleta de animais (2012), três amostras de aspirados de linfonodos e 46 camadas leucocitárias foram obtidas de cães soropositivos para leishmaniose. Em um segundo estágio de coleta (2013), foram coletadas amostras de camada leucocitária de 376 cães de 20 localidades próximas à fronteira com o Paraguai, rio Paraná, centro e periferia da cidade. Seis isolados foram obtidos, quatro da primeira etapa (4/49) e dois da segunda etapa (2/376); estes isolados foram submetidos à amplificação com iniciadores K26F/R, e a análise de sua sequência confirmou a espécie como L. infantum. A autoctonia dos casos foi confirmada, pois 100% dos cães nunca haviam saído da cidade. O estudo confirma a emergência de leishmaniose visceral canina no Paraná com identificação de L. infantum em cães da cidade de Foz do Iguaçu. Assim, medidas de controle devem ser elaboradas e implementadas por órgãos públicos e instituições de pesquisa do Brasil, Argentina e Paraguai em parceria com o objetivo de controlar a disseminação de zoonoses e os casos humanos de LV.

Evidence of a sylvatic enzootic cycle of Leishmania infantum in the State of Amapá, Brazil

Abstract INTRODUCTION: Leishmania infantum was considered to be absent from Amapá until 2017 when canine infection was detected. However, there is a lack of knowledge about which reservoir species are involved in transmission in this region. METHODS: Between 2014 and 2016, 86 samples from wild mammals and 74 from domestic dogs were collected in Wajãpi Indigenous Territory and were tested for the presence of deoxyribonucleic acid (DNA) of Leishmania. RESULTS: The DNA of Le. infantum was detected in two rodent samples, Dasyprocta sp. and Proechimys cuvieri. CONCLUSIONS: This is the first evidence characterizing a sylvatic transmission cycle of Le. infantum in the State of Amapá.

Primera caracterización molecular de Leishmania infantum en pacientes con leishmaniosis visceral de la Provincia de Misiones, Argentina / First molecular characterization of Leishmania infantum species in patients infected with visceral leishmaniasis in Misiones province, Argentina

Resumen Introducción. La leishmaniosis cutánea por Leishmania braziliensis ha sido tradicionalmente endémica en Argentina y se han sido descritos casos de compromiso visceral después de una leishmaniosis cutánea inicial. La leishmaniosis visceral emergió en Argentina en el año 2006 en la ciudad de Posadas, provincia de Misiones, afectando tanto a humanos como a perros. Objetivo. Identificar el agente etiológico a nivel de especie de los pacientes diagnosticados con leishmaniosis visceral en Misiones y describir sus características clínico-epidemiológicas. Materiales y métodos. Se estudió una serie de 24 pacientes con diagnóstico confirmado de leishmaniosis visceral en la provincia de Misiones en el período 2009 al 2016. Para la identificación de Leishmania spp., los pacientes fueron sometidos a estudios diagnósticos indirectos (serológicos) y directos (microscopía, detección de ADN y secuenciación). También, se estudiaron variables como edad, sexo, lugar de residencia, y signos y síntomas clínicos indicativos de leishmaniosis visceral. Resultados. De los 24 pacientes estudiados, 18 (75 %) eran hombres y 6 (25 %) eran menores de cuatro años. La manifestación clínica más frecuente fue el síndrome febril prolongado en 21 (87,5 %) de los pacientes, seguido de esplenomegalia en 17 (70,8 %). Se identificó la especie Leishmania infantum en todos los pacientes estudiados. Conclusión. Este hallazgo constituye la primera identificación de la especie L. infantum en pacientes autóctonos de la provincia de Misiones. El estudio evidenció la importancia de la PCR para el manejo epidemiológico de la leishmaniosis visceral en Argentina.

Abstract Introduction: Cutaneous leishmaniasis caused by L. braziliensis has been historically endemic in Argentina and several cases of visceral leishmaniasis following initial cutaneous leishmaniasis have been reported. Visceral leishmaniasis started to appear in Argentina in 2006 in the city of Posadas, Misiones province, affecting both humans and dogs. Objective: To identify the etiologic agent to species level in patients with visceral leishmaniasis diagnosis in Misiones province and describe its clinical and epidemiological characteristics. Materials and methods: A cohort of 24 patients from Misiones province was studied from 2009 to 2016, all with a confirmed diagnosis of visceral leishmaniasis. To identify the Leishmania species involved, patient samples were analyzed by microscopy, serologic studies, DNA detection, and sequencing. Variables such as age, sex, place of residence, clinical signs and symptoms consistent with visceral leishmaniasis were also recorded. Results: 75% (18/24) of the patients studied were males and 25% (6/24) were younger than 4 years. The most frequent symptom was a prolonged fever in 87.5% of the patients (21/24), followed by splenomegaly in 70.8% (17/24). Leishmania infantum was the only parasite species identified in all patients. Conclusion: This finding constitutes the first molecular identification of the Leishmania infantum species in autochthonous patients of Misiones province, Argentina. This study highlights the importance of PCR for species identification in epidemiological studies of visceral leishmaniosis in Argentina.

Molecular detection of Leishmania infantum DNA according to clinical stages of leishmaniasis in dog / Deteção molecular de DNA de Leishmania infantum em diferentes estágios clínicos da leishmaniose em cães

Abstract The aim of this study was to compare molecular tests used to diagnose Leishmania spp. in dogs with different stages of infection. Blood and conjunctival swab (CS) samples from dogs classified in four clinical stages were subjected to different PCR protocols (13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S and LEISH-1/LEISH-2 primers). To the study, 22.3% (48/215) of dogs were classified as without clinical signs, 67.5% (145/215) stage I (mild disease), 7.0% (15/215) stage II (moderate disease) and 3.2% (7/215) stage III (severe disease). The results showed that in blood samples, 13A/13B detected a significant higher number of positive dogs in stage I (25/145) and in total (42/215) (p≤0.05). However, when CS samples were tested, no difference was observed (p>0.05). On the other hand, in blood samples, MC1/MC2 detected significantly fewer positive dogs classified as without clinical signs (0/48), in stage I (0/145) and in total (1/215) (p≤0.05). Likewise, in CS samples, this primers showed also lower detection (1/215) (p≤0.05). So than, we can conclude that PCR on blood samples with 13A/13B primers has greater capacity to detect positive dogs, mainly at the initial of clinical disease than do other primers and MC1/MC2 are not a good choice to detect Leishmania infantum infection in dogs.

Resumo O objetivo deste estudo foi comparar testes moleculares usados para diagnosticar Leishmania spp., em cães apresentando diferentes estágios de infecção. Amostras de sangue e suabe conjuntival (SC) de cães classificados em quatro estágios clínicos foram submetidas a diferentes PCRs (primers 13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S e LEISH-1/LEISH-2). Para o estudo, 22,3% (48/215) dos cães foram classificados como sem sinais clínicos, 67,5% (145/215) estágio I (doença leve), 7,0% (15/215) estágio II (doença moderada) e 3,2% (7/215) estágio III (doença grave). Os resultados mostraram que, em amostras de sangue, 13A/13B detectou número significativamente maior de cães positivos no estágio I (25/145) e no total (42/215) (p≤0,05). No entanto, quando as amostras de SC foram testadas, nenhuma diferença foi observada (p>0,05). Por outro lado, no sangue, MC1/MC2 detectou significativamente menos cães positivos sem sinais clínicos (0/48), em estágio I (0/145) e no total (1/215) (p≤0,05). Da mesma forma, em amostras de SC, MC1/MC2 também apresentou menor detecção (1/215) (p≤0,05). Assim, a PCR em amostras de sangue com 13A/13B tem maior capacidade de detectar cães positivos, principalmente no início da doença do que outros primers, e o par de primers MC1/MC2 não é uma boa escolha para detectar infecção por Leishmania infantum em cães.

Molecular detection of Leishmania spp. in cattle from Brazil by means of PCR using internal transcribed spacer 1 / Detecção molecular de Leishmania spp. em gado no Brasil por PCR com espaçador interno transcrito 1

Abstract Leishmania spp. are important agents of human and animal leishmaniases that have an important impact on public health. In this study, we aimed to detect the circulation of Leishmania spp. in cattle from a visceral leishmaniasis non-endemic area of the state of São Paulo, Brazil. DNA was extracted from blood samples from 100 heifers in the municipality of Pirassununga and was amplified using primers specific for the first internal transcriber spacer (ITS1), to assess the presence of trypanosomatids. The assays revealed that one sample presented bands of between 300 and 350 base pairs. In GenBank, this sample matched 100% with Leishmania infantum (314 base pairs). The results suggest that cattle can be infected by Leishmania infantum in Brazil.

Resumo Leishmania spp. são agentes causadores das leishmanioses em humanos e em animais, gerando grande impacto à saúde pública. Este estudo objetivou detectar a circulação de Leishmania spp. em área não endêmica para leishmaniose visceral de São Paulo, Brasil. Foram extraídas amostras de DNA de 100 novilhas da cidade de Pirassununga. Estas amostras foram amplificadas com os iniciadores específicos para tripanosomatídeos Internal Transcriber Spacer 1 (ITS1). Os ensaios revelaram uma amostra com bandas entre 300 e 350 pares de base (pb). A amostra demonstrou 100% de identidade com Leishmania infantum (314 pb). Os resultados sugerem que o gado pode ser infectado por L. infantum no Brasil.

First autochthonous case of canine visceral leishmaniasis in Rondônia, Brazil, a region with no history of visceral leishmaniasis

Abstract This report describes the first autochthonous case of canine visceral leishmaniasis in Rondônia, northern Brazil. A canine resident of the municipality of Cacoal, with clinical signs and symptoms of visceral leishmaniasis, was treated by a veterinarian. Samples were analyzed by a reference laboratory. Dual-path platform (DPP) assay, indirect immunofluorescence technique (IIT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR), isolation in a culture medium, and direct parasitological analysis were performed. DPP assay, IIT, and ELISA revealed positive results for Leishmania; PCR identified the species as Leishmania infantum. Based on the clinical presentation and test results, canine visceral leishmaniasis was diagnosed.

Genetic variability of Leishmania infantum in naturally infected dogs in the state of Bahia, Brazil / Variabilidade genética de Leishmania infantum em cães naturalmente infectados no estado da Bahia, Brasil

Abstract In Brazil, Leishmania infantum mainly affects humans and dogs. The state of Bahia presents many dogs that are positive for this parasite. Despite the importance of epidemiology in this region, there are still very few studies that have assessed the genetic characteristics of L. infantum. The aim of this study is to investigate the genetic variability of L. infantum isolated identified in naturally infected dogs, in order to verify occurrence of subpopulation of this parasite in the different biomes existing in the state of Bahia. Thirty-two samples of L. infantum were analyzed, which were obtained isolated in dogs from the Mata Atlântica (rainforest), Caatinga (semi-arid scrub forest), and Cerrado (a vast tropical savannah eco-region) Bahia municipalities' biomes. All animals presented with clinical changes suggestive of Leishmania spp. and they exhibited positive reactions to serological tests. kDNA analysis with RFLP markers revealed the presence of genetic variability and gene flow in subpopulations of L. infantum; samples from the Mata Atlântica areas were genetically more similar to those from the areas of Caatinga and they were less likely to resemble those of the Cerrado. This data may be used to investigate the dissemination of parasite in the canine population of state of Bahia.

Resumo No Brasil a Leishmania infantum afeta principalmente o homem e os cães. O estado da Bahia apresenta elevado número de cães positivos por este parasito. Apesar da importância epidemiologia para a região, ainda há poucos estudos que avaliam as características genéticas de L. infantum. Objetivou-se com este estudo investigar a variabilidade genética de cepas de L. infantum identificadas em cães naturalmente infectados, a fim de verificar a ocorrência de sobpopulações do parasito nos diferentes biomas existentes no estado da Bahia. Foram analisadas 32 amostras de L. infantum isoladas em cães de municípios baianos distribuídos nos biomas Mata Atlântica, Caatinga e Cerrado. Todos os animais apresentavam alterações clínicas sugestivas de Leishmania spp. e reação positiva em exames sorológicos. A análise do kDNA com marcadores RFLP revelaram a presença de variabilidade genética e fluxo gênico nas subpopulações de L. infantum sendo que as amostras das áreas de Mata Atlântica foram geneticamente mais semelhantes as das áreas de Caatinga e foram mais distantes daquelas oriundas do Cerrado. Estas informações podem auxiliar em investigações de dispersão do parasito na população canino do Estado da Bahia.

Standardization and evaluation of a duplex real-time quantitative PCR for the detection of Leishmania infantum DNA: a sample quality control approach

Abstract INTRODUCTION: Molecular techniques have been shown to be alternative methods for the accurate detection of infectious and parasitic diseases, such as the leishmaniases. The present study describes the optimization and evaluation of a duplex real-time quantitative PCR (qPCR) protocol developed for the simultaneous detection of Leishmania infantum DNA and sample quality control. METHODS: After preliminary tests with the newly designed TaqMan® probes for the two targets ( L. infantum and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PD) gene), the duplex qPCR protocol was optimized. For the evaluation of the standardized protocol, human blood samples were tested (n=68) and the results were compared to those obtained by reference diagnostic techniques. Statistical analyses included percentage agreement and the Kappa ( k ) coefficient. RESULTS: The detection limit of L. infantum DNA reached 2x10 2 fg (corresponding to ~1 parasite) per µL of blood (ε: 93.9%). The percentage agreement obtained between the duplex VL qPCR and the reference techniques was individually obtained as follows: molecular: 88.3% ( k =0.666; 95% CI 0.437-0.894, good), and serological: 81.7% ( k =0.411; 95% CI 0.125-0.697, moderate). Between the reference techniques, the percentage agreement was 86.7% ( k =0.586; 95% CI 0.332-0.840, moderate). CONCLUSIONS: The new duplex VL qPCR protocol indicated good potential for the accurate, fast, and reliable detection of L. infantum DNA, when applied as a complement to the classical diagnostic tools already available, especially in health or research reference centers.

Análise de dados de sequenciamento de RNA voltados à comparação de expressão gênica visando a um melhor entendimento dos mecanismos de resistência aos antimoniais

A origem do que hoje chamamos de Sequenciamento de Nova Geração foi impulsionada pelo sequenciamento do genoma humano e pela necessidade de inovações técnicas, tecnológicas e computacionais que reduzissem os custos e o tempo de análise. Essa necessidade possibilitou de uma maneira sem precedentes o aumento dos estudos de genômica e transcriptômica. O melhor entendimento do transcriptoma de um organismo é essencial para identificar e interpretar como a maquinaria gênica atua nos processos biológicos. Um grupo de organismos de grande interesse em saúde pública e causadores do conjunto de doenças negligenciadas conhecidas como leishmanioses são os parasitos protozoários do gênero Leishmania. Anualmente, estima-se que aproximadamente 300 mil novos casos e 20 mil mortes relacionadas à leishmaniose visceral são registrados. O tratamento das leishmanioses é problemático devido principalmente à alta toxicidade dos antimoniais pentavalentes e o surgimento de parasitos resistentes a esses compostos. Por fim, considerando que esses parasitas são agentes etiológicos de uma importante doença negligenciada, pesquisas que tragam novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos de resistência aos compostos antimoniais são de particular importância. Neste contexto, analisamos comparativamente o transcriptoma de duas linhagens de Leishmania infantum (MHOM/BR/74/PP75), uma selvagem (LiWTS) e outra resistente ao antimônio trivalente (SbIII) (LiSbR) com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos que possam estar associados aos mecanismos de resistência

Para tanto, utilizamos a plataforma de sequenciamento Illumina HiSeq 2000 para o sequenciamento das amostras. Parte do processo analítico envolveu a reanotação funcional dos genes de L. infantum JPCM5 que foi utilizada como cepa referência para o processo de mapeamento das leituras geradas. As amostras foram avaliadas quanto à sua qualidade com os programas Prinseq e FastQC. As sequências adaptadoras e de baixa qualidade foram removidas utilizando o Trimmomatic. O TopHat2 foi utilizado para o processo de mapeamento das leituras no genoma de L. infantum JPCM5 e o DESeq2 para a realização das análises estatísticas

Esse pipeline analítico e a busca por genes que possuíssem um p-valor ajustado 1.2 possibilitaram a identificação de 719 genes diferencialmente expressos (699 com regulação positiva e 20 com regulação negativa) quando comparamos a linhagem resistente tratada 0.06 mg de SbIII (LiSbR 0.06) com a linhagem LiWTS , e 779 genes diferencialmente expressos (749 com regulação positiva e 30 com regulação negativa) quando comparamos as linhagens LiSbR 0.06 e LiWTS 0.06, ambas tratadas com baixa dose de antimônio. No entanto, não observamos nenhum gene diferencialmente expresso quando comparamos as linhagens selvagens tratadas e não tratadas com SbIII, indicando ausência de transcrição gênica diferencial devido ao estresse da droga. Além disso, realizamos a classificação funcional dos produtos proteicos destes genes de acordo com o Pfam. Observamos que grande parte desses genes codificam chaperonas e proteínas relacionadas a estresse, transportadores, proteínas estruturais, proteínas envolvidas nos processos de ubiquitinação e processamento de DNA e RNA, enzimas metabólicas (envolvidas nos processos de proteólise, metabolismo de ácidos graxos, carboidratos e proteínas, entre outras), controle do ciclo celular, proteínas que atuam na mediação da interação com outras proteínas, proteínas com função desconhecida na biologia de Leishmania spp. e proteínas hipotéticas. Neste estudo observamos um conjunto de genes diferencialmente expressos em L. infantum evidenciando que o fenômeno de resistência desse parasito aos compostos antimoniais é multigênico e complexo

Obtenção e caracterização de uma cepa atenuada de Leishmania Infantum mediante deleção do gene Kharon1

Apesar da vacinação ser considerada a melhor estratégia para prevenir a infecção por Leishmania, não existe até o momento nenhuma vacina segura e eficaz para uso humano disponível. As vacinas atenuadas, consideradas padrão-ouro para proteção contra patógenos intracelulares, têm sido largamente estudadas como estratégia de imunização contra as leishmanioses. Dessa forma, com o objetivo de obter uma cepa atenuada de Leishmania, foi realizado o nocaute do gene Kharon1 (Kh1) em L. infantum, o qual foi descrito como sendo essencial para citocinese das formas amastigotas de L. mexicana.Os mutantes LiKh1-/- foram obtidos com sucesso por meio de recombinação homóloga e a deleção de ambas as cópias do gene foi confirmada por PCR, qPCR e Southern blot. Em seguida foram também obtidos mutantes complementados nos quais o gene Kh1 foi reinserido nos parasitos LiKh1-/- (add back).Apesar das formas promastigotas dos mutantes LiKh1-/- não apresentaram alteração do crescimento quando comparadas com LiWT, parasitos LiKh1-/- apresentam alteração morfológica, que não é detectada nos parasitos complementados. Apesar de Kh1 estar indiretamente relacionado com o transporte de glicose, os mutantes LiKh1-/- não apresentaram alteração da captação de glicose e nem alteração na sensibilidade ao antimônio

Por outro lado, as formas amastigotas de LiKh1-/- foram incapazes de manter a infecção em macrófagos humanos ou murinos, formando estruturas multinucleadas que não sobrevivem por mais de 16 dias in vitro. A análise do ciclo celular dos mutantes demonstrou que as amastigotas LiKh1-/- apresentam retenção em G2/M, confirmando que os mutantes LiKh1-/- apresentaram defeito na citocinese. Os parasitos deficientes em Kh1 também possuem menor capacidade de manter a infecção in vivo, até mesmo em camundongos imunossuprimidos. A deleção do gene Kh1 não interferiu na produção de óxido nítrico pelos macrófagos peritoneais murinos.Os resultados obtidos in vitro e in vivo nesse trabalho demonstram que os parasitos LiKh1-/- apresentam fenótipo atenuado, devido à alteração na divisão celular. Esses parasitos poderão ser futuramente testados como potenciais candidatos vacinais contra as leishmanioses

Análise das regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV / Analyzing of the polymorphic regions of HASPB (K26) gene from Leishmania infantum in positive clinical samples for visceral leishmaniasis and VL/HIV co-infection

A leishmaniose visceral(LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2°C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 por cento de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.